Introduction

La microbiologie est la science qui étudie la biologie microscopique qui nous entoure. Elle n’a fait l’objet de recherches scientifiques de manière intense que depuis un siècle environ.

Quelques siècles en arrière, qui aurait cru à l’existence d’organismes microscopiques ? Ces organismes eux n’ignorait pas notre existence. Ils ont mis en place des liens avec les êtres macroscopiques, ce qui les rendent autant dépendant de nous, que nous d’elles. Au cours de ce dernier siècle, la microbiologie a subi un fort développement.

L’Homme possède une vue qui ne lui permet pas de voir des objets de taille inférieure à 0.1 mm. Les micro-organismes tels les bactéries possèdent une taille bien inférieure à celle-ci. C’est la raison pour laquelle l’existence d’un monde microscopique était ignorée de l’Homme.

Le progrès technologique et l’invention de matériel de plus en plus performant a permis à l’Homme de pouvoir faire la rencontre avec les micro-organismes. Le premier instrument qui l’a permis est un instrument optique : le microscope. Celui-ci fut mis en place en 1695 par Zacharias Janssen (1588-1631), un fabricant de lentille néerlandais. Antoni van Leeuwenhoek (1632-1723), un drapier néerlandais a utilisé ces lentilles pour observer des textures de tissus. Il a apporté des améliorations aux lentilles qui plus tard lui permettront d’observer des micro-organismes ou « animalcules ». La date d’observation de ces premiers micro-organismes reste inconnue, mais à partir du 7 septembre 1674 il a commencé à rédiger des lettres où il a signalé leurs présences. Dans ses lettres il a décris une bactérie que l’on appelle aujourd’hui « protozoaire ».

Avant A. van Leeuwenhoek et Z. Janssen une théorie a été mise en place par Girolamo Fracastoro (1478-1553), un médecin italien. Il a suggéré en premier que la présence de micro-organismes soit la cause de maladies.

C’est à partir de Louis Pasteur (1822-1895) et avec l’aide des chercheurs contemporains que l’importance des micro- organismes a été révélée et que la génération spontanée a été contredite. Les micro-organismes sont souvent liés à l’analyse de plusieurs problèmes de la biologie moderne.

Notre projet de travail a consisté en la recherche des découvertes, « trouvailles » faites en microbiologie depuis Louis Pasteur. Nous avons étudié les progrès apportés à la microbiologie et ce qu’il en découle. Pour cela nous avons d’abord fait d’importantes recherches informatiques et bibliographiques et nous avons mis en place une présentation Powerpoint® pour la soutenance.

La première partie du projet concerne la naissance de la microbiologie avec Louis Pasteur. Nous regarderons de plus près qui il a été, son travail et l’influence qu’il a eu sur les autres chercheurs. Puis nous parlerons des micro-organismes, de leurs modes de fonctionnements et leurs morphologies. Ainsi nous observerons les progrès apportés à la microbiologie au niveau des techniques de recherche et d’analyses. Enfin pour conclure nous présenterons les recherches mises en place pour une espèce de bactérie ainsi que nos recherches en IAA (Industrie Agro-Alimentaire)

1. La naissance de la microbiologie

1.1 La microbiologie avant Louis Pasteur

Avant Louis pasteur, la microbiologie a été étudiée par des savants de l’époque, entre autres Zacharias Janssen, Girolamo Fracastoro, et Antoni van Leeuwenhoek. Ils ont été des personnes ignorées du monde de cette époque, ont gagné leurs vies avec diverse emplois où ont été des gens fortunés, amateurs de science. Ils ont fait des découvertes qui ont permis à d’autres d’en faire encore plus, on appelle cela le progrès

La théorie la plus célèbre en biologie de cette période a été la génération spontanée. Cette théorie a eu 2500 ans avant d’être lourdement contredite. Son principe est que l'apparition d'un être vivant est sans ascendant, sans parent. On l’a nomme aussi spontéparité ou hétérogénie. A l’époque, cette théorie a été influente et n’a pas facilité les recherches microbiologiques qui ont eu tendance à ne pas allez dans son sens.

Le premier qui a abordé expérimentalement le problème de cette théorie Francesco Redi (1626-1691). Il montra que les asticots qui donnent naissance aux mouches ne proviennent pas d’une génération spontanée mais d’œufs de mouche.

Lazzaro Spallanzani (1729-1799) lui a emboité le pas avec la reproduction des mammifères a partir d’ovules et de spermatozoïdes. Ces travaux participent à la remise en cause la génération spontanée dont la contestation ne verra son achèvement que bien plus tard grâce à Louis Pasteur.

1.2 Qui est Louis Pasteur ?

Louis Pasteur est un scientifique français, chimiste et physiciens de profession. Cet homme est né dans le Jura en 1822 et est mort à Seine-et-Oise 1895. Non seulement il a pratiqué la chimie et la physique (exemple : étude des cristaux que forment les atomes) mais il a été un adepte de la microbiologie. Il a étudié à la faculté des sciences de paris où il a écrit ses thèses. Ce qu’il lui a permis d’obtenir la médaille Rumford.

Après la fin de ces études L. Pasteur est devenu professeur de faculté : pendant cinq ans à Strasbourg et à Dijon et après à la faculté des sciences de Lille en 1854.

En 1857, il est élu administrateur de la direction des études à l'École normale supérieure. Après cela, Louis Pasteur a étudié la fermentation et d’autres travaux et a obtenus quelques prix en récompenses.

1.3 Le travail de Louis Pasteur

En 1861, L. Pasteur a publié des travaux sur la génération spontanée. Ce travail lui a valu le prix Jecker.

L. Pasteur s’est intéressé à la fermentation concernant la conservation de la bière. Ses travaux ont cherché à résoudre les problèmes rencontrés par les industries alimentaires de la région de Lille. Il a prouvé en 1848 que les ferments utilisés dans la fermentation de la bière sont des ferments vivants qui permettent lors de la synthèse d’alcool à partir du sucre, de maintenir la propriété que possède le sucre à dévier le plan de polarisation de la lumière. L’un des problèmes concernait la conservation de la bière. En effet, dans la bière et dans le vin de l’acide est produit. Il a trouvé que cette acidité est due à la présence de bactéries. Ce n’est que plus tard vers 1865 que L. Pasteur a proposé une méthode pour les détruire. Ce processus est maintenant une opération courante en industrie : la pasteurisation (brevet d’invention ci-dessous).

Figure 1 : Copie du brevet d'invention pour un procédé relatif à la conservation des vins

http://www.cienciaviva.pt/projectos/inventions2007/texte.pdf

Elle consiste à température du produit alimentaire au delà de 72ºC et de le refroidir rapidement après, alors les bactéries sont dénaturées. La conservation alimentaire est née.

Ces travaux ont été possibles grâce aux découvertes d’Adamo Fabbroni (Savant italien ; le premier à soutenir en 1787 que la fermentation du vin est faite grâce a des organismes microscopiques) et de Jean-Baptiste Dumas (1800-1884) (Chimiste et homme politique français avec a décrit le ferment comme étant un être organisé en 1843).

L. Pasteur a consacré environ dix ans de sa vie à étudier la fermentation. Il a découvert la capacité de certains organismes à se développer sans avoir besoin d’O2 : organismes anaérobies. Ainsi les levures à l’abri de l’air vont produire une plus grande quantité d’alcool que celles présentes à l’air libre. La fermentation est la synthèse d’alcool, donc il à découvert l’inhibition de la fermentation par ajout d’air : L’effet Pasteur (1857). Les travaux sur la fermentation lui ont apporté la médaille Copley en 1874, le Mérite agricole en 1883 (fermentation des vins) et ses recherches fut additionné à celles qui ont tournée autour des maladies de la bière dans un recueil : Les études sur la bière (1876). Toutes ses études sur la fermentation ne lui ont pas permis d’obtenir de la gratitude de la part d’autres chercheurs.

En effet avec les résultats qu’il a obtenus, il a contredit la théorie de la génération spontanée en 1859. Il est le premier qui a permis de prouver expérimentalement l’invalidité de cette théorie. C’est par ailleurs, ce qui lui a fait perdre ses fonctions d’administrateur au sein de la faculté. Il s’est battu plusieurs années pour démontrer que cette théorie où « la vie pourrait apparaître à partir de rien, et les microbes être générés spontanément » est fausse. Et son combat contre cette théorie a été fini en 1861.

L. Pasteur a aussi pratiqué le flambage des vases, ainsi que d’autres techniques de stérilisation, qui ont contribué à la naissance de l’asepsie. Il a participé à plusieurs expériences qui partent du principe que pour tuer des micro-organismes présent dans un volume de 2-3L, il faut une température de 120°C pendant vingt minutes. Pour de plus grand volume il faut un temps de chauffage plus long. Toutes les expériences qui ont été faite à ce sujet ont été conduites sous la direction de Louis Pasteur à Paris en 1885.

Il s’est intéressé à la maladie du charbon où il met au point le vaccin en 1881. D’autres vaccins furent crées, ceux-ci à partir d’un matériel et de technique bien précis. Il a utilisé des filtres et des autoclaves mis au point pas Charles Chamberland, biologiste et physicien français (1851 1908).

1.4 L’influence de Louis Pasteur

Louis Pasteur a fait de grandes découvertes qui ont pour certaines, pu influencer d’autres recherches ou le lancement d’autres projets.

Louis Pasteur s’est inspiré du travail Adamo Fabbroni (qui a prouvé expérimentalement que des bouillons chauffés dans des tubes clos hermétiquement sont resté stérile un long moment) pour créer la pasteurisation, qui a elle-même influencé M. Appert qui a mis en place bien plus tard le processus d’Appertisation.

La mise en place de l’asepsie par Louis Pasteur a changé considérablement les méthodes de recherche microbiologiques et aussi les méthodes médicales qui ont été déplorables à cette époque. Il a attiré l’attention sur les germes présents dans l’air l’eau et les outils médicaux en 1878 devant l’académie de médecine et a demandé à ce que certaines habitudes soient changées pour éviter la propagation de germe. Il a conseillé le nettoyage des mains, lavage et recouvrement des plaies et l’utilisation d’instruments d’une propreté parfaite.

Cette conception a déjà été utilisée avant L. Pasteur par Claude Pouteau, un chirurgien français, et Jaques Delpech, un médecin français. L.Pasteur a préconisé l’asepsie et que d’autres chercheurs comme Octave Terrillon en 1883 et William S. Halsted l’on suivit dans cette démarche.

==> En résumé, Louis pasteur était un chercheur qui a permis la mise en place de nombreuses recherches dans différents secteurs : physique, chimique et microbiologique. Pour la pluparts, celle-ci elles ont finis par la remise d’une médaille ou d’un titre ou ont indirectement facilités et engagés d’autres recherches de son époque et bien plus tard.

Il a fait un travail remarquable sur la fermentation et sur les vaccins (maladie du charbon, maladie du Choléra). Il s’est opposé à des thèses de manière rigoureuse.

La génération spontanée a été déclarée comme une hypothèse fausse.

Grâce a tout ce que Louis Pasteur a fait au cours de sa vie, il a laissé un héritage scientifique qui a été réutilisé pour faire de nombreuses autres recherches.

Les découvertes faites à partir de ses recherches peuvent aussi bien concerner les caractères des micro-organismes que des techniques pour les observer, les identifier et les classer.

2. Les critères microbiologiques

2.1 Macroscopique

Sans microscope, on peut observer les aggloméras de bactéries ou colonies. On peut alors distinguer la taille, l’aspect des contours, la couleur, la transparence et le type (figure 2).

Il existe trois types de colonies :

Types S qui signifie smooth ou lisse, on un aspect crémeux et ont généralement un contour lisse et régulier, sont semi-bombée et une surface brillantes.

Types M qui signifie muqueux, on un aspect filant et on le même contour que les types S mais sont plus bombées et plus brillantes

Types R, rough ou rugueux, ont un contour irrégulier, sont plates et mates.

Figure 2 : Aspect des colonies de Saccharomyces

http://artic.ac-besancon.fr/svt/act_ped/svt_lyc/second/mutalevures/Mutations%20Levures.htm

2.2 Microscopie

La morphologie des bactéries uniquement observable avec un microscope, est aussi ce qu’on peut qualifier « d’apparence physique ». En effet la morphologie d’un micro-organisme regroupe différents caractères qui diffèrent d’une espèce à une autre. Ils peuvent traduire par exemple un mode de multiplication, de protection ou de déplacement du micro-organisme.

2.2.1 La taille

Nous avons en premier lieu la taille des bactéries, qui est un caractère compris dans la morphologie. La taille des micro-organismes peut varier de 0,2-0,3 µm (Mycoplasmes) à 750 µm (Thiomargarita namibiensis). Au début, les microscopes ont eu un grossissement pouvant aller jusqu'à 200 fois ce qui n’a pas facilité leurs observations.

2.2.2 La forme

La forme des micro-organismes fait aussi partie de la morphologie. La forme change d'une espèce à une autre, et la classification a été orientée en fonction de l'observation

microscopique.

On classifie les bactéries en trois grandes formes : les formes sphériques ou ovale (les coques), les formes allongées (les bacilles) et les formes spiralées (spiridilles). Ces différentes formes peuvent être développées, la forme « bâtonnet » peut être fusiforme, arrondis ou carrés. Dans certains cas, on parle aussi de coccobacilles qui sont des bacilles très courts et ramassés.

2.2.3 L’agencement

A partir des différentes formes des micro-organismes on obtient des associations différentes. Cet agencement dépend du mode de multiplication de la bactérie et se forme au fur et à mesure des divisions cellulaires.

Les agencements des « coques » et des « bacilles » ne sont pas les même. Les coques peuvent ne pas avoir de regroupement particulier, elles sont donc dites isolées ou seules. Elles peuvent avoir un regroupement particulier qui ce fait par deux (diplocoque), par quatre (tétrade), par huit (cubique) ou en amas, soit en « grappe de raisin » ou « chainette » (Figure 3).

Figure 3 : Agencement des coques

http://www.utpl.edu.ec/eva/descargas/material/187/G21106.6.pdf

2.2.4 La paroi

La paroi est présente chez toutes les bactéries à l'exception des mycoplasmes. Elle leur permet de résister aux pressions osmotiques et leur donne leurs formes.

On a deux principales divisions des bactéries : les Gracillicutes (Gracilis cutis: peau fine) et les Firmicutes (Firmus cutis : peau dure).

Hans Christian Joachim Gram (1853-1938), bactériologiste danois, a étudié la botanique à Copenhague. Il a manifesté un grand intérêt pour les plantes, ce qui l'a conduit à utiliser le microscope et à se lancer dans la pharmacologie. Il a voyagé dans de nombreux pays d'Europe pour étudier en plus de la pharmacologie, la bactériologie. C'est à Berlin, en 1884, qu'il a découvert une méthode de coloration des bactéries qui porte son nom aujourd’hui, et qui est largement utilisé aujourd'hui dans la classification des bactéries (http://www.medarus.org/Medecins/MedecinsTextes/gram_hans.htm).

La coloration de Gram est donc une étape très importante dans l’identification des Eubactéries. Son intérêt est de donner une information rapide et médicalement importante, car le pouvoir pathogène et la sensibilité aux antibiotiques sont radicalement différentes. La coloration dépend également de l’état physiologique des bactéries, en effet certaines bactéries « perdent » la coloration en vieillissant. Le fait que certaines bactéries la perdent avec le temps, montre qu’il y a une modification des propriétés structurales et donc une différenciation basée sur cette technique est d’une importance taxonomique.

La coloration de Gram se base sur une différenciation des parois à l’alcool. On a deux types de bactéries, les Gram + et Gram -. Respectivement, la première est composée d’une paroi qui est en grande majorité du peptidoglycane, très épais (Figure 4), et la second, de très peu de peptidoglycane mais d’une « deuxième membrane » composé, comme la membrane cytoplasmique, de phospholipide (Figure 5).

Figure 4 : Paroi des bactéries Gram+ http://www.geniebio.ac-aix-marseille.fr/biospip/spip.php?article85

Figure 5 : Paroi des bactéries Gram - http://www.geniebio.ac-aix-marseille.fr/biospip/spip.php?article85

La coloration de Gram nécessite tout d’abord, une opération de fixation (soit à l’alcool pendant 5 min, soit un passage rapide à la flamme). Ensuite il y a quatre étapes : une coloration au cristal violet pendant 2 min, mordançage au lugol pendant 1 min, puis une décoloration à l’alcool et une recoloration à la safranine. La coloration au cristal violet, permet de colorer les deux types bactéries en violet. Ensuite le lugol, qui est un mordant, permet de renforcé cette coloration.

L’étape de décoloration à l’alcool permet de décoloré les bactéries Gram- sans pour autant décoloré les autres. Cela n’affecte que les Gram -, car les Gram + étant « protégé » plus longtemps contre les effets de l’alcool, dû au faite que les lipides sont très solubles dans l’alcool et que les Gram + en sont pratiquement dépourvu, l’alcool ne rentre pas dans le cytoplasme de la bactérie Gram +. Les bactéries Gram + restent donc violettes, mais les gram- sont incolores. On procède pour finir, à une étape de sur-coloration à la safranine afin de pourvoir observer les bactéries Gram- en rose.

Ce n’est qu’en 1933, date où le premier microscope électronique dépasse le microscope optique qu’on a pu réellement voir la paroi autrement que par déduction grâce à la coloration.

2.2.5 Pili ou fimbriae

Les pili sont des organites facultatifs qui sont retrouvés plus fréquemment chez les Gram -. Uniquement observable au microscope électronique à transmission, ces appendices sont fixés au niveau de la membrane cytoplasmique est sont composés de piline (PM= 17000). Il en existe deux types selon leurs fonctions : les communs et les sexuels.

Les pili communs ou pili I, permettent aux bactéries d’adhérer à certaines surfaces comme les muqueuses et sont donc des facteurs de virulence. Ils sont distribués en grand nombres autour de la bactérie, environ une centaine.

Les pili sexuels ou pili F, permettent la conjugaison dans le but d’échanger des plasmides. Ils sont plus longs que les pili communs et en plus faible proportion, entre un et quatre.

Figure 6 : Différence entre pili communs et sexuel

Figure 7 : Pont cytoplasmique http://www.bio.espci.fr/scolarite/c_BIO/compl/bacterie7.gif

2.2.6 Flagelles et cils

Ils permettent aux bactéries de se mouvoir, afin de proliférer et d’accéder à de nouvelles sources de nourriture.

Les flagelles sont plus longs que les cils et sont mobiles par rotation alors que les cils le sont par battements. Les flagelles peuvent être observés au microscope optique par « gonflement » grâce à la précipitation de nitrate d’argent autour de ce dernier. Son épaisseur dépend de l’espèce mais sa longueur est supérieur à la bactérie : 6-20 µm.

Selon les espèces, on a différents types de ciliature :

Figure 8 : Les différents types ciliatures

2.2.7 Les spores

La morphologie comprend aussi la présence de spores car c’est un caractère de différenciation. La spore est un organite facultatif qui se forme dans le cytoplasme, elle permet à la cellule de survivre à des conditions qui sont défavorables à la survie du système végétatif (manque de nourriture, température élevé, salinité…). Elle se déclenche très souvent en fin de croissance exponentielle et au début de la phase stationnaire. Ainsi la spore est une forme de résistance.

Pour expliquer le fonctionnement prenons le cas où la condition défavorable est une température élevé. Pour passer d’une cellule végétative à une spore il y a trois étapes. La cellule produit au départ une pré-spore, elle va pour cela répliquer son ADN et arranger le double en forme de bâtonnet dans un coin de la cellule. Après cela la cellule va former un septum transversal en provoquant une invagination de la membrane. De là, la pré-spore est terminée et il va y avoir une formation des différentes couches de la spore.

Figure 9 : Structure d'une spore

Une fois toutes les couches terminées, la cellule pourra sécréter la spore dans le milieu extracellulaire. Une fois que la spore est sécrétée, elle peut germer dès que les conditions du milieu sont redevenues favorables. La présence de spore dans une bactérie peut être remarquée avec une coloration standard par l’absence de coloration au centre de la bactérie, on observe alors comme une coloration bipolaire. Elle peut également être mise en évidence grâce à la coloration au vert de malachite qui permet d’observer les spores en vert et les formes végétatives en rose.

Le vert malachite a été utilisé en peinture, en joaillerie et en cosmétique, dans de nombreuse région tel que la Sibérie, l'Oural, le Turkestan, la Hongrie, la Chine (haute Antiquité), en Inde, au Tibet, dans le Sinaï et en Égypte ancienne (dès le IIIème millénaire avant Jésus-Christ) (http://www.dotapea.com/verts.htm). Il a été aussi utilisé comme antifongique et antibactérien dans les produits de la mer et les ovo produits. Mais ce n’est qu’en 1992, au Canada, qu’on a démontré que les produits traités représentaient un risque sanitaire.

La coloration au vert de malachite peut se faire à froid (moins bonne efficacité) comme à chaud (dégagement de vapeur toxique). Puis une sur-coloration à la safranine pour voir les cellules végétatives.

Les spores peuvent prendre différentes formes et position dans la bactérie (Figure 10), ce qui permet une pré identification de l’espèce (Figure 11)

Figure 10 : Taille et position des spores

Figure 11 : Classification des principales bactéries sporulantes

2.2.8 La capsule

La capsule n’est pas présente chez toutes les bactéries. C’est un organite non indispensable à sa survie mais elle permet aux bactéries, et à celles qui en possèdent de se protéger de la phagocytose par chimiotactisme négatif, ce qui constitue un facteur de virulence.

Elle est le plus souvent de nature polysaccharidique, mais parfois protéique et est donc non colorable par la méthode classique. Il faut utiliser la coloration à l’encre de chine pour la mettre en évidence. La capsule apparaît alors sous la forme d'un halo clair et réfringent au microscope, comme ci-dessous.

Figure 12 : Aspect au microscope des bactéries capsulées

2.3 Besoins culturaux

Selon les conditions environnementales, on peut trouver deux états physiologiques chez les bactéries. La première étant un état végétatif durant lequel des biosynthèses équilibrées sont assurées, elles permettent une croissance plus ou moins rapide. La seconde est un état de repos où on a un minimum d'échange avec le milieu extérieur et donc une survie sans multiplication.

Toutes les bactéries ont besoins de nutriments pour se développer, qui sont soit une source d’énergie, soit de carbone, soir d’azote ou encore de minéraux. Elles ont également une exigence vis-à-vis de la température, de l’humidité, du pH et du gaz qui l’entoure.

Tout d’abord, on distingue deux types de nutriments dans les milieux de culture. On a les besoins élémentaires (carbone, azote, soufre, phosphore, minéraux) et les besoins spécifiques (facteur de croissance, métabolite essentiel). En fonction des besoins, on peut classer les bactéries en type trophique, présenté dans le tableau ci-dessous.

Energie/ Donneur H+/e- Organique Inorganique

Lumineuse Photoorganotrophe Photolithotrophe

Substrat organique Chimioorganotrophe Chimiolitotrophe

Tableau 1 : Nom des micro-organismes en fonction de l'énergie et du substrat utilisées.

2.3.1 Besoins essentiels

Toutes les bactéries ne sont pas ubiquistes, elles ont une préférence pour un ou plusieurs types de milieux avec lequel elles ont évoluée et vont donc utiliser un type d’énergie et un type de donneur d’électron.

Les phototrophes transforment l’énergie lumineuse en énergie chimique. Il y a deux composés qui peuvent être utilisé en tant que donneur d’électrons, pour les photoorganotrophes (ex : Famille des Athiorhodaceae) se sont des composés organique et pour les photolithotrophes (ex : Famille des Thiorhodaceae) ce sont des composés inorganique. Les chimiotrophes métabolisent des substances chimiques pour en tiré leur énergie.

Le carbone est nécessaire à la formation de toutes les molécules organique et doit être fournit en quantité suffisante. Ces exigences nutritionnelles conduisent à envisager deux catégories de bactéries : les autotrophes et les hétérotrophes. La première catégorie est capable de se développer dans un milieu inorganique avec le dioxyde de carbone comme seul source de carbone.

L’azote est utilisé par les bactéries pour synthétiser leurs protéines, qui représentent 10% de leur poids sec. Certaines sont capables d’utiliser l’azote atmosphérique, comme par exemple Rhizobium, qui vit en symbiose avec certaines légumineuses en leurs permettant de fixé l’azote.

Le phosphore est utilisé pour la synthèse d’acides nucléiques ou d’ATP, et le soufre pour la synthèse des acides aminés soufré (méthionine et cystéine) (http://www.bacteriologie.net/generale/nutritioncroissance.html).

Les minéraux se s’épart en deux catégories, les microéléments et les oligoéléments. Les microéléments, par opposition aux macroéléments ci-dessus, sont des éléments présents en assez faible quantité mais nécessaire à l’équilibre physico-chimique de la bactérie (sodium, potassium, magnésium, chlorure) et il est souvent nécessaire d’en rajouter dans le milieu. Les oligoéléments sont des éléments présents en quantité infime, mais sont nécessaire au fonctionnement des enzymes et des cofacteurs (fer, cobalt, cuivre, calcium).

Ces éléments sont la plus par du temps, apporté par des produits servant à la fabrication du milieu comme l’eau par exemple.

2.3.2 Besoins spécifiques

Certaines bactéries exigent, pour leur développement, des substances organique quelles sont incapables de le synthétiser. Lorsqu’elle n’en on pas besoin, elles sont dit prototrophe (ex : Escherichia coli sur milieu minimum). Si elles exigent un ou plusieurs éléments, elles sont dites auxotrophe (ex : Proteus vulgaris a besoin de nicotinamide pour synthétiser le NAD).

On a en premier lieu, comme facteurs de croissance, les vitamines. Elles sont les précurseurs des coenzymes et sont généralement présente dans le milieu à hauteur de 1 à 23 µg/L (de 0,001% à 0.02% des constituants du milieu). On a ensuite les bases purique et pyrimidique, qui servent à la synthèse des acides nucléique, et sont à hauteur de 10 mg/L (soit 1%). Pour finir on a les acides aminés, qui servent à la synthèse protéique, et qui sont aux alentours de 25 mg/L (soit 2,5%).

Parfois si une souche est auxotrophe pour un élément, et qu’elle se trouve à côté d’une autre souche, qui elle le fabrique et le sécrète, elle poussera. Ce phénomène s’appel la syntrophie.

2.3.3 Besoins physiques

Nous avons en premier facteur physique, la température. Les températures basses ralentissent la croissance des bactéries et les hautes températures les tues. On a donc entre les deux une température optimale de croissance, et on les regroupe en trois catégories : les psychrotrophes qui poussent a basse température, environ 10°C, comme les Pseudomonas ; les mésophiles qui poussent à 30-37°C, comme les bactéries pathogène ; et enfin les thermophiles, qui poussent à 35-55°C comme les Clostridium ou les Bacillus.

En second facteur, on a le pH. Dans les milieux, il est voisin de la neutralité (souvent entre 6 ,5 et 8), et influence la croissance des bactéries par un pH optimal et par inhibition. Certaines espèces sont acidophiles comme les Lactobacilles, et d’autre préfère les pH alcalins comme les Vibrio.

On a ensuite la présence ou l’absence de dioxygène. Les souches poussant obligatoirement avec présence de ce gaz sont dites aérobie strict. Celle qui ne pousse pas avec sa présence, car toxique, sont dites anaérobie strict. Celle qui pousse aussi bien avec, que sans, sont dites aéro-anaérobie facultative.

Pour terminer, on a la présence d’eau disponible pour les bactéries ou « aw » (comprit entre 0 et 1), communément appelé l’humidité. C’est un facteur très déterminant car elle permet le transport des nutriments et leur dissolution, et les réactions d’hydrolyse. Dans l’industrie on se base sur ce principe afin de conserver les aliments, comme le séchage, la déshydratation,…Certaines bactéries ne se développe qu’a des fortes valeurs d’« aw » de 0,97 ( Acinetobacter spp avec un « aw » > 0,99), d’autres sont capable d’aller jusqu'à 0,75 pour les bactéries halophiles.

3. Les progrès de la microbiologie

3.1 Les techniques et le matériel

3.1.1 Asepsie

C’est grâce à Louis Pasteur que l’asepsie a été utilisée jusqu'à aujourd’hui. Au fil de l’histoire les chercheurs ont créé divers manières de procéder selon l’appareil, les micro-organismes …

Les différentes techniques de stérilisation ont été classées en général dans trois grands groupes : agents physiques, agents chimiques, et agents chimio-thérapeutiques.

Tous les agents possèdent deux types d’effets : bactéricide et bactériostatique. Ils ont disposés les deux effets ou d’un seul selon le micro-organisme présent.

Les agents physiques sont liés en général par la chaleur, les radiations électromagnétiques ou électroniques.

Les agents chimiques sont en général des oxydants, alcools, métaux lourd et leurs sels, phénols, aldéhydes, savons, détergeant ou des gaz.

L’oxydants le plus connu que se soit au niveau médical ou alimentaire est l’eau de javel (NaOCl) découverte en 1789. Elle est utilisée pour les nettoyages de surface et possède un effet bactéricide.

La réaction de fabrication de l'eau de Javel :

Cl2 + 2 NaOH → NaCl + NaClO + H2O

Pour les alcools, il est question d’éthanol et de méthanol. L’éthanol est utilisé dans des produits alimentaires comme conservateur. Les alcools détiennent la faculté de détruire les grams + et -, les champignons, les virus. Ils ne bénéficient pas d’un effet dénaturant sur les spores bactériennes et ont été prévus pour l’antisepsie d’une peau saine ou pour la désinfection de surface ou d’outils.

Enfin il y a des agents chimio-thérapeutiques, ils concernent les antibiotiques.

Les antibiotiques sont des substances d’origines microbiennes ou dérivés qui tuent les micro-organismes sensibles ou inhibent leurs développements. Ils sont élaborés par des micro-organismes vivants (éventuellement modifiés par la suite) qui agissent à des concentrations faibles.

On mesure l’activité des antibiotiques grâce à différentes notions : la concentration minimal inhibitrice ou CMI, la concentration minimal bactéricide ou CMB, la concentration critique inférieur (petit « c ») et supérieur (grand « C »).

La CMI est la concentration la plus faible pour laquelle la croissance bactérienne n’est plus visible. La CMB est la concentration la plus faible permettant d’atteindre le taux de survie de 0,01%.

En 1855 un appareil qui a été très utilisé et l’est toujours, a permis la stérilisation de matériel utilisé en laboratoire : le bec bunsen. Cette innovation a été inoculée par Robert Wilhelm Bunsen (1811-1899). L’Histoire peut faire penser que c’est lui le créateur du bec bunsen, mais les honneurs reviennent à son assistant de laboratoire qui a été l’un des chercheurs principaux sur cette invention. En effet l’assistant, Peter Desdega a perfectionné en 1855 un modèle déjà créé par Michael Faraday.

Le bec bunsen a été utilisé pour stériliser par exemple des pipettes pasteur, inventé pas L.Pasteur pour inoculer des bactéries dans un milieu.

On a distingué deux sortes de flammes : la flamme forte ou chauffante encore appelé stérilisante. Par exemple, pour un traitement électromagnétique on utilise les ultraviolets (découverts en 1801 par le physicien allemand Johann Wilhelm Ritter (1776-1810)).

Figure 13 : Types de flammes de bec bunsenhttp://fr.wikipedia.org/wiki/Fichier:Bunsen_burner_flame_types_.jpg

3.1.2 Observation

La microbiologie est liée à l'observation d'organismes microscopiques.

Depuis son invention fin du XVIe siècle, le microscope optique est resté le moyen le plus rapide pour observer et donner des caractéristiques microbiennes. Il a été modifié a plusieurs reprises. Les modifications se situent au niveau de l'apparence, du poids et de la performance de l'objet (Figures 14 et 15).

Figure 14 : Microscope optique (1751) http://fr.wikipedia.org/wiki/Microscopie_optique

Figure 15 : Modèle Voigt & Hochgesang (1890)http://fr.wikipedia.org/wiki/Microscopie_optique

Au fil du temps, les chercheurs se sont efforcés de trouver de nouveaux moyens d’observation qui donnent des résultats plus précis et plus nets.

Il y a trois groupes de microscopes : les optiques, les électroniques et ceux a sondes locale.

Les microscopes optiques possèdent des différences en eux. Ils ont des fonctionnements différents : microscope à champs clair, à champs sombre, à contraste de phase...

Le microscope à contraste de phase a été conçu par Frederik Zernike, un physicien hollandais dans les années 1930. Le prix Nobel lui a été attribué pour cette invention en 1953. Ce dispositif a joué sur les contrastes de lumière en modifiant les longueurs d'onde. Ainsi le noyau des cellules apparait sombre. L'inconvénient de cet appareil c'est qu'il a une limite sur la taille des observations. Si elles sont trop petites, un halo se forme et l'image perd de sa netteté.

Le microscope électronique est une invention des ingénieurs allemands Ernst Ruska et Max Knoll en 1931. Leur prototype de microscope électronique est basé sur les recherches théoriques de Louis de Broglie en 1924-1926. Sa théorie a prouvé que des champs magnétiques ou électrostatiques ont pu être utilisés comme lentilles. A l'échelle commerciale le microscope électronique a été mis en vente pour la première fois en 1939.

Ce microscope électronique a été dit en transmission. D'autres microscopes électroniques ont été confectionnés : le microscope électronique à balayage (1965) par Charles Oatley de l'université de Cambridge et le microscope à haute résolution (1946 dans les laboratoires de RCA).

Pour donner un exemple d'évolution en microbiologie avec ces microscopes, la recherche a été la vérification du terme « procaryote » dans les années 1950, lorsque l'absence de noyau dans la cellule a été observée. Ce qui a admis terme de cellule « procaryote ».

Figure 16 : Microscope électronique d’Ernst Ruska en 1933http://fr.wikipedia.org/wiki/Microscope_%C3%A9lectronique

3.1.3 Matériel

Après louis Pasteur, la microbiologie a été améliorée au niveau des matériels utilisés en laboratoire. Les progrès apportés dans ce domaine ont aidé aux nouvelles découvertes en microbiologie.

Ces nouveaux appareils ont permis entre autre la culture de micro-organismes. Ils on eu pour but d'ensemencer, de faire de la numération, de l'isolement ou même de la détection.

L'objet le plus connu en laboratoire est la Boite de Pétri de Julius Richard Pétri (1852-1921) en 1887. Ce bactériologiste a inventé ce dispositif lorsque qu’il a été l'assistant du docteur Robert Koch.

Les pipettes Pasteur ont-elles aussi joué un rôle dans cette innovation technologique. Elles ont servis dans le prélèvement des micro-organismes.

Les appareils de plus gros calibres eux, sont dédiés généralement au domaine industriel. On peut prendre différents exemples d’appareils : fermenteur, autoclave…

En 1679 Denis Papin (1712-1714), un physicien mathématicien français, a inventé l’autoclave. Ce chercheur a été connu pour ses travaux sur les machines à vapeur. L’autoclave est l’appareil est fermé de manière hermétique et sous pression. Cette pression est associée à une vapeur d’eau et une eau surchauffée, qui provoque la destruction des germes et donc la stérilisation.

On a vu apparaitre le port de tenues spécifiques pour ses activités.

3.1.4 Milieu de culture

Les milieux de cultures sont utilisés pour les croissances de micro-organismes. Ce sont des mélanges de substances, qui ont été capable d’assurer la multiplication des bactéries en laboratoire. Le milieu doit assurer les conditions optimales pour le métabolisme bactérien : ph, pression osmotique, aérobiose ou anaérobiose, potentiel redox. Ils sont obligatoirement stériles. Leurs états physiques varient selon leurs utilisations ou leurs buts. Mais en général ils sont classés dans différents groupes selon leurs fonctions: les milieux usuels, de différenciations, sélectives et enrichies.

Les milieux usuels, ou milieux minimums sont composés des constituants minimum aux développements microbiens.

Par exemple, la gélose nutritive a été inventé par Fannie Eilshemius-Hesse, après 1881 quand elle a rejoint l’équipe de recherche de Robert Koch. Elle a proposé l’utilisation de l’agar-agar.

De même, la gélose lactosée au pourpre de bromocrésol (BCP) est un milieu non sélectif, utilisé pour les détections et isolement des entérobactériacées dans l’eau et les produits alimentaires. Ce milieu est initialement créée par M. Wurtz en 1892, il est modifié depuis le tournesol est remplacé par le pourpre de bromocrésol. Cette modification a rendu le milieu plus sensible et plus stable.

Les milieux sélectifs permettent la croissance d’un groupe d’espèces ou d’une espèce bactérienne. Ils sont composés d’éléments nutritifs et de substances inhibitrices ou sélectives. Le milieu de Chapman en est un exemple. Sa composition permet le développement des bactéries halophiles, tel que les Staphylococcus et permet de connaitre leurs interactions vis-à-vis du mannitol.

Les milieux enrichis sont des milieux qui ont la faculté de permettre le développement de bactéries exigeantes. Additionné aux substances de base, leurs buts est d’améliorer la croissance des bactéries. La gélose au sang fait parti de ce type de milieu.

3.2 L’arrivée de la génétique

La génétique est un autre domaine scientifique que celui de la microbiologie. En effet, la génétique a consiste à étudier l’ADN sous toutes ces formes ainsi que l’hérédité. Les cellules procaryotes ou eucaryotes sont composées d’ADN qui va contribuer au bon fonctionnement de la cellule.

Les débuts de la génétique ont été significatifs à partir de Johann Gregor Mendel (1822-1884), un moine et botaniste autrichien, qui a mis en place les lois de Mendel. Ce moine a définit les termes de phénotype et génotype. Les lois de Mendel ont été redécouvertes chez les végétaux en 1901 par Hugo de Vries (1848-1935) en Hollande, Carl Correns (1964-1933) et Erich von Tschermak (1871-1962) en Allemagne.

William Bateson (1861-1926), biologiste britannique a écris un livre en 1902 Gregor Mendel’s principe of Heredity qui a eu pour but de défendre ces lois. Ce chercheur a été aussi le premier à définir le terme de génétique en 1906. Ce qui a engendré l’idée d’une présence de particules indépendantes qui se transmettent selon des lois statistiques de génération en génération.

En même temps, à la faculté des sciences de Nancy, un biologiste Lucien Cuénot (1866-1951) a également pratiqué des recherches sur la génétique. Il a démontré en 1902 que les lois de Mendel sont aussi vraies pour les animaux et a découvert en 1905 l’existence d’un gène létal chez l’animal. Mais aussi en 1907 l’épistasie et en 1908 la pléiotropie. L’épistasie caractérise l’influence que peut porter un ou plusieurs gène(s) sur un ou plusieurs autre(s) gène(s). La pléiotropie elle, représente l’influence d’un gène sur plusieurs caractères phénotypiques. C’est à cette période, qu’une théorie est apparue sur une interaction entre les gènes et les enzymes.

L’ADN a été uniquement théorique et a été définis comme un matériel de l’hérédité en 1883 par August Weismann.

Pour obtenir des résultats plus rapide et plus intéressant des recherches ont été faites sur les drosophiles. Le chercheur qui a travaillé notamment sur ce projet est Thomas Hun Morgan, un généticien américain (1866-1945). Il a eu le prix Nobel de physiologie et médecine en 1933 pour sa théorie sur les chromosomes, des supports physiques de l’information génétique.

Les progrès technologique et l’avancement de recherches en matière de génétique a permis de définir l’ADN en 1950. Cette découverte a été faite par James Watson et Francis Crick. Plus le matériel et les théories se confirment plus les chercheurs s’enfoncent profondément dans la structure physique des gènes. En 1965, les codons sont définis par trois biologistes français François Jacob, André Lwoff, et Jacques Monod.

La génétique a apporté une importante source d’information très utile pour la microbiologie. En effet depuis les découvertes des micro-organismes, les classifications ont été faites sur les bases de leurs morphologies, de leurs fonctionnements ou leurs consommations de nutriments. Les bactéries ont pu être classées selon leurs caractères : biochimiques (classification en biotypes ou biovars), antigéniques (classification en sérotypes ou sérovars), pathogéniques (classification en pathotypes ou pathovars), etc.

Les classements ont pu être encore basés sur : leurs températures de croissance, les besoins nutritionnels, le mode respiratoire…

Pour classer tous ces organismes on parle de taxonomie, un terme inventé en 1813 par un botaniste suisse Augustin Pyrame de Candolle (1778-1841) dans sa Théorie élémentaire de la botanique ou exposition des principes de la classification naturelle et de l'art de décrire et d'étudier les végétaux. A partir de données génétiques la taxonomie a évolué et ainsi également la classification des micro-organismes. Celle-ci reposant maintenant sur le matériel génétique sans pour autant oublier les classifications et les définitions latines. Un article récent montre bien que les anciennes définitions ne sont pas oubliées.

Ainsi l’avancement des progrès technologique et scientifiques du XXIe siècle a permis la possibilité de séquencer des génomes entiers. Les exemples de micro-organismes dont les génomes entiers ont été séquencés sont : Saccharomyces cerevisiae en 1996, Escherichia coli en 1997 et Arabidopsis thalianaen 2000.

Les micro-organismes ne sont pas les seuls à avoir connu un changement de classification a cause de la génétique. En effet une taxonomie des virus en 1962 a été introduite par Woff.

Cette classification est faite par rapport aux ribosomes (figure 18). L’ADN est composé de gènes qui sont eux-mêmes composés de séquences et qui vont être transcrites en ARNm. Ils vont ensuite être traduits par des ribosomes en protéines. Les ribosomes sont composés d’ARN ribosomal. (George Emil Palade (1952-2008), un scientifique de nationalité roumaine et américaine, a découvert les ribosomes en 1974. Il a obtenu un prix Nobel qui finalement a été partagé avec Albert Claude et Christian de Duve.)

Le ribosome est divisé en deux sous unité 20S et 5S qui forme la sous unité 50S et 16S qui forme la sous unité 30S. La petite sous unité permet la lecture de l’ARNm et la grande va la traduire en acides aminés.

La classification bactérienne en fonction de la composition génomique se fait à partir de la formule suivante :

GC(%)=(G+C)/(A+T+C+G)×100

On obtient un pourcentage avec trois règles qui sont les suivantes : variation < 3% : intra-espèce, < 10% : intra-genre et GC (%) : parenté étroite.

Après cela une technique d’hybridation avec des amorces (figure 17) est mise en place pour regarder la parenté entre les organismes. Un séquençage peut se faire de la manière suivante : extraction de l’ADN, transcriptase inverse injecté, séquençage de l’ARN 16S, comparaison avec les banques de données (exemple : logiciel BLAST) et constitution d’un arbre phylogénétique. Finalement il y a séquençage d’ARNr 5S et 16S et donc d’ADN.

Figure 17 : Exemple d’homologie de séquence d’ADN chez Pseudomonashttp://bacterioweb.univ-fcomte.fr/bibliotheque/M1-BBCM/Classification_biodiversite.pdf

Figure 18 : Image au microscope électronique de ribosomes fixés sur la membrane http://www.bscb.org/?url=softcell/ribo

3.3 La microbiologie en IAA : les bactéries lactiques

Les bactéries lactiques sont des micro-organismes transformant la source de carbone en acide lactique. La peau, le système digestif et les muqueuses sont des lieux où ces organismes sont normalement présents. Grâce à leurs sécrétions d’acide lactique, une protection contre les micro-organismes pathogènes est établie. Ces bactéries sont les plus célèbres dans la transformation laitière et fromagère et permettent de recoloniser la flore intestinale si le cas de problèmes intestinaux se présente.

Pour avoir des exemples de bactérie lactiques, un frotti d’un yaourt avec Streptococcus thermophilus et Lactobacillus bulgaricus se trouve sur l’image ci-dessous.

Figure 19 : Frotti d’un yaourt http://mcavalla.free.fr/bts_ppt/Bacteries_lactiques.ppt

Les bactéries sont utilisées depuis l’époque des pharaons dans toutes sortes de produits. Leurs existences n’est connu de ce monde que depuis la naissance de la microbiologie.

Beijerinck en 1901 a mis en place une nouvelle classification des lactobacilles, qui est un genre appartenant à l’ordre Lactobacillales. Les bactéries appartenant à ce groupe peuvent croitre en association entre elles.

C'est le chercheur russe Elie Metchnikoff, prix Nobel 1908, qui a initié l'approche scientifique autour des laits fermentés et des yaourts en montrant que le yaourt traditionnel provient de la fermentation du lait sous l'action de deux ferments ou bactéries lactiques : une souche de Lactobacillus (Lactobacillus bulgaricus ou acidophilus) et Streptococcus thermophilus.

La première acidifie le milieu en transformant le lactose en acide lactique et la seconde fabrique plus spécifiquement les substances aromatiques. Des bactéries lactiques sont associées avec des moisissures ou des levures dans certaines fabrications comme le fromage. Ainsi l’évolution de la microbiologie a permis de sélectionner des bactéries identifiées pour la production industrielle.

Le cas de bactéries utiles en productions industrielle a été mis en évidence mais il faut savoir que des bactéries pathogènes existent aussi. Des précautions ont été mise en place afin d’éviter des problèmes sanitaires très bien connu de la population. Dans les bactéries, des espèces sont pathogènes comme Streptococcus pneumoniae, le responsable de pneumonies. Celle-ci ne se transmet pas par les produits alimentaires mais elle reste pour autant un pathogène appartenant à un groupe de bactéries très utilisées en industrie alimentaire. Pour d’autres groupes de bactéries ou pathogènes liées à des dégradations organoleptiques où des risques de santé pour le consommateur sont présent, des procédures sont créés. Les premières publications sur l’HACCP ont commencé dans les années quatre-vingts dix. C’est par le biais de la mise en place de règle sanitaire que la qualité sanitaire est née.

==>En conclusion, au cours de l’histoire les découvertes et inventions scientifiques se sont succédé. Des innovations et des découvertes dans d’autres secteurs ont permis de faire avancer les recherches microbiologiques, entre autre la génétique. L’observation a été le premier objectif de cette science.

Ainsi l’innovation au niveau des microscopes, de l’asepsie et des méthodes microbiologies à cette époque a été importante.

La somme des connaissances en microbiologie a eu pour conséquence d’améliorer des productions alimentaires. Les productions alimentaires qui sont liées aux micro-organismes ont pu mettre en place des moyens de sélections et de quantification de micro-organismes. Des souches pathogènes de bactéries ont été déterminées et elles sont responsables de contaminations de produits alimentaires. C’est pourquoi il y a eu la mise en place de règles sanitaires strictes qui sont toujours en évolution aujourd’hui, surtout avec la mise en place de règles européennes et internationales.

Conclusions

Finalement la microbiologie a connu un essor théorique et technologique lors de ces derniers siècles. Louis Pasteur a été un des plus grands fondateurs de cette science. Il a fait d’importantes découvertes dans la fermentation, l’asepsie, et il a démentit la théorie de la génération spontanée.

La microbiologie se définit comme étant une science qui a pour but d’observer, identifier et de classer les micro-organismes. Ainsi des chercheurs ont permis l’apparition de nouveaux matériels : microscopes, fermenteur,… ; de nouvelles techniques de colorations, manipulations et classifications laissés à de nouveaux chercheurs pour continuer le progrès. D’autres domaines scientifiques ont joués un rôle important dans la microbiologie, la physique, la génétique dans la détermination de génome complet de micro-organismes et dans la conception de microscopes.

Ainsi les classifications connues à l’époque ont été réajustés par rapport aux séquences déterminées. Les chromosomes sont les organites sur lesquelles repose le travail de la génétique pour classer les micro-organismes.

Tout cet avancement technologique et théorique dans le domaine de la microbiologie a amélioré les productions industrielles. Les souches sont déterminés, séquencés, classés et déterminé si utiles ou dangereuses dans des productions industrielles. Si les bactéries sont déclarées comme pathogènes, un procédé pour les détruire est crée. Un plan sanitaire est aussi mis en place afin d’éviter les problèmes sanitaires.

Ainsi l’histoire de microbiologie a bien évolué depuis Louis Pasteur, et a connu un essor important grâce à la génétique.

Quelle sera la prochaine étape qui va faire avancer la microbiologie ?

Sources

Livres

Jean-Paul Larpent. Mémento technique de microbiologie. 1997. 1039p.

R.Y. Stanier et M.Doudoroff. Microbiologie générale.

Bulletin de la Société Française de Microbiologie : février 2003 vol.18, N°HS ; avril 2005 vol.20, N°HS ; octobre 2008 vol.23, N°3 ; décembre 2008 vol.23, N°4.

A.Meyer, J.Deiana, A.Bernard. Cours de microbiologie générale. Doin, 2004. 416p. Biosciences et techniques. ISBN 2-7040-1170-2 (http://books.google.fr/)

Prescott, Harley, Klein. Microbiologie. Edution 2, 2003. 1164p.

ISBN 2-8041-4256-6 (http://books.google.fr/)